克仑特罗酶联免疫试剂盒质量标准
www.nongmintv.com  农民网  2009-06-13  

本品系用克仑特罗偶联蛋白的抗原,克仑特罗单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测猪组织和尿液中克仑特罗的残留量。

【物理性状】试剂盒外观完整,内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装。克仑特罗抗体工作液、底物液、终止液、标准品溶液、浓缩洗涤液为透明溶液,酶标记物为浅黄色溶液,试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】取已包被好的酶标板12孔,每两孔分别加入0µg/L、0.1µg/L、0.3µg/L、0.9µg/L、2.7µg/L、8.1µg/L标准溶液各20µL,再加入克仑特罗抗体工作液80µL,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干,加入100µL酶标二抗,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反应15min,用50µL终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值(B)平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以克仑特罗浓度(µg/L)的自然对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。

IC50(即0浓度标准溶液的吸光度值50%处所对应的克仑特罗浓度)范围应在0.25µg/L~0.56µg/L之间。

【特异性测定】取已包被好的酶标板18孔,每两孔分别加入0µg/L、0.1µg/L、0.3µg/L、0.9µg/L、2.7µg/L、8.1µg/L标准溶液和阴性尿样本提取液、1µg/L和2µg/L克仑特罗添加的阳性尿样本提取液各20µL,再加入克仑特罗抗体工作液80µL,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干,加入100µL酶标二抗,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反应15min,用50µL终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值(B)平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以克仑特罗浓度(µg/L)的自然对数为X轴,百分吸光度为Y轴,绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和1µg/L和2µg/L克仑特罗添加的尿样的测定浓度。

阴性尿样本测定值在0.25µg/L以下,1µg/L和2µg/L克仑特罗添加浓度回收率应在55.0%~120.0%之间。

【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔,每两孔分别加入0µg/L、0.1µg/L、0.3µg/L、0.9µg/L、2.7µg/L、8.1µg/L标准溶液20µL,其它20孔加入0.9µg/L的标准溶液20µL,再加入克仑特罗抗体工作液80µL,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干,加入100µL酶标二抗,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反应15min,用50µL终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的0.9µg/L标准溶液的吸光度值变异系数(%)应≤25%(n=20)。

【适用范围】用于定量、定性检测猪组织(肌肉、肝脏等)和尿液中克仑特罗的残留量。

【用法和结果判定】

1. 溶液配制

1.1 稀释洗涤液:将20X浓缩洗涤液摇匀,用去离子水以1:20的比例稀释,临用前配制。

1.2 0.05M盐酸液: 取盐酸4.2mL,加水至1000mL。

1.3 0.05M磷酸盐缓冲液(pH3.0):称取磷酸二氢钾6.8g,加水900mL,用稀磷酸调节pH至3.0,用水稀释至1000mL。

1.4 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 3.0): 称取磷酸二氢钾68g,加水900mL,用磷酸调节pH至3.0,用水稀释至1000mL。

2、样品的前处理

2.1猪组织(肌肉、肝脏等)样本处理方法

2.1.1 5.0g粉碎的样品与25mL 0.05M HCL混合,振荡1.5h,以达到均质的目的;

2.1.2 称6g均质物(相当于1g肝脏),加入离心瓶中;

2.1.3 10~15℃,3000g以上的转速离心15min;

2.1.4 转移上清液到另一个离心瓶中,加300µL 1M NaOH混合15min;

2.1.5 加入4mL 0.5M磷酸二氢钾缓冲液pH3.0,简单的混合后在4℃保存,至少1.5h或过夜(非常重要);

2.1.6 10~15℃,3000g以上的转速离心15min,分离全部上清液(应该是清亮的,非常重要),使其升至室温(20~24℃),然后用RIDA C18柱纯化(见RIDA C18柱纯化步骤)。

2.2 尿样本处理方法

尿样不用处理,取20µL清亮尿样直接测定(如果尿样浑浊一定要过滤或3000g离心15℃,10min直至得到清亮尿样),暂不使用的样品应冷冻保存。

3. RIDA C18柱纯化步骤

3.1 用3mL甲醇(100%)洗涤柱子,流速为1d/s;

3.2用2mL洗涤液洗涤柱子(0.05M磷酸二氢钾缓冲液,pH3.0);

3.3 样品进柱(肝,肉或组织的全部上清液);

3.4 用2mL洗涤液洗涤柱子(0.05M磷酸二氢钾缓冲液,pH3.0);

3.5 用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2min干燥柱子;

3.6 用2mL甲醇(100%)洗脱样品,流速为15d/min;

3.7 用50~60℃的弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂;

3.8用1mL去离子水溶解干燥的残留物,取20µL进行分析。

4. 检测步骤

4.1 将试剂盒从4℃冷藏环境中取出并将所需试剂从盒中取出,置于室温(20~24℃)平衡30 min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀;

4.2 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中,将不用的微孔条放入自封袋,保存于2~8℃,不要冷冻;

4.3 编号:将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品均需做2孔;

4.4 反应:往酶标板微孔中加标准溶液或试样溶液20µL,然后加入已稀释好的克仑特罗抗体工作液80µL,用盖板膜封板,37℃恒温箱中反应30min。

4.5 倒出孔中液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,去除孔中液体。每孔加入250µL洗涤液,15s后倒出孔中液体,用吸水纸拍干,如此重复操作共洗板5次。

4.6 加酶标记物:加入酶标记物100µL,用盖板膜封板,37℃恒温箱中反应30min。取出酶标板,如前述洗板5次;

4.7 显色:每孔加入A、B底物液各50µL,轻轻振荡混匀,37℃恒温箱避光显色15min;

4.8 测定:每孔加入终止液50µL,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测),测定每孔吸光度值(OD值)。

5、结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

百分吸光度值(%)=B×100%

B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标,以克仑特罗标准品浓度的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中克仑特罗实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样品的准确、快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存,保存期为6个月。

【规格】每个试剂盒含96孔板1块;克仑特罗标准品6瓶,1mL/瓶(0µg/L、0.1µg/L、0.3µg/L、0.9µg/L、2.7µg/L、8.1µg/L);克仑特罗抗体工作液1瓶,7mL;酶标记物工作液1瓶,12mL;20倍浓缩洗涤液1瓶,40mL;底物液A液1瓶,7mL;底物液B液1瓶,7mL;终止液1瓶,7mL;高浓度标准品(1µg/mL)1瓶,1mL;盖板膜1张;自封袋1个;说明书1份;质量报告1份。

【注意事项】

1、试剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌,防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证,合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象,则视该批试剂盒为不合格。

稿源:中国兽药信息网 
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