阿维菌素类药物酶联免疫试剂盒质量标准
www.nongmintv.com  农民网  2009-06-13  

本品系用阿维菌素药物偶联蛋白的抗原、阿维菌素类药物多克隆抗体和酶标记羊抗兔及其它试剂制成。用于定量、定性检测牛组织中阿维菌素类药物的残留量。

【物理性状】 试剂盒外观完整,内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装。阿维菌素类药物抗体工作液、底物液、终止液、阿维菌素标准品溶液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液为透明溶液,酶标记物为浅黄色溶液,试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】 取已包被好的酶标板12孔,每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液各20µL,再加入抗体工作液80µL,用盖板膜盖板,37℃环境中反应30min,取出用洗涤液按每孔250μL,洗板4-5次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干,加入100µL酶标二抗,37℃反应30 min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反应15 min,用50µL终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值(B)平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以AVM浓度(µg/L)的自然对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。

IC50(即0浓度标准溶液的吸光度值50%处所对应的AVM浓度)范围应在2.32µg/L ~4.57µg/L之间。

【特异性测定】 取已包被好的酶标板18孔,每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液和牛肉样品提取液、20µg/L和50µg/L两个浓度阿维菌素添加的牛肉样本提取液各20µL,再加入抗体工作液80µL,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干,加入100µL酶标二抗,37℃反应15 min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反应15 min,用50µL终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值(B)平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以AVM浓度(µg/L)的自然对数为X轴,百分吸光度为Y轴,绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和20µg/L和 50µg/L两个浓度阿维菌素添加的组织样品的测定浓度。

阴性样品测定值在3µg/L以下,以20µg/kg 和50µg/kg 两个浓度阿维菌素样本进行添加,回收率应在60.0%~120.0%以上。

【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔,每两孔分别加入0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L标准溶液20µL,其它20孔加入4.5µg/L的标准溶液20µL,再加入抗体工作液80µL,37℃反应30min,取出洗板5次,拍干,加入100µL酶标二抗,37℃反应30 min,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50µL,避光37℃反应15 min,用50µL终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的4.5µg/L标准溶液的光吸收值变异系数(%)应≤25%(n=20)

【适用范围】 用于定量、定性检测牛组织(肌肉、肝脏)中阿维菌素类药物的残留量。

【用法和结果判定】

1. 溶液配制

1.1 稀释复溶液:将2X浓缩复溶液摇匀,用水以1:2比例稀释,临用前配制。

1.2 稀释洗涤液:将20X浓缩洗涤液摇匀,用水以1:20比例稀释,临用前配制。

2. 样品前处理

2.1 牛组织(牛肉、牛肝)样本处理方法

2.1.1 取牛组织(肌肉、肝脏)进行均质。

2.1.2 称取2±0.05g样品,加入8mL乙腈,振荡提取20min,3000g以上离心10min,取上清液5mL备用。

2.1.3 取sep-pak vac12cc(2g)柱,称取3g无水硫酸钠平铺在滤板上,加入10mL乙腈溶液。

2.1.4 加入提取液5mL,收集滤液,待提取液流干,再加入4mL乙腈清洗残留液。

2.1.5 将收集滤液置60℃下氮气吹干,加入1mL稀释了的复溶液复溶。

2.1.6 取20µL进行分析。

3. 检测步骤

3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出,置于室温(20~24℃)平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 取出需要数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃不要冷冻。

3.3 编号:将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 用加样器每孔加标准品或样本20mL 后,每孔再加80mL抗体溶液。

3.5 用盖板膜盖板后置于37℃环境反应30min。

3.6 小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用洗涤液每孔250mL充分洗涤4~5次,每次间隔10~20s,用吸水纸拍干。

3.7 加酶标记物:每孔加入100mL。用盖板膜盖板后置37℃环境反应30min,取出重复洗板步骤。

3.8 显色:每孔加入底物液A液50mL,再加底物液B液50mL,轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。

3.9 测定:每孔加入终止液50mL,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测),测定每孔OD值。

4. 结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

B

百分吸光度值(%)=—×100%

B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值

以阿维菌素浓度的自然对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法,计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件,更便于大量样品的快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存,保存期为6个月。

【规格】每个试剂盒含96孔板一块;AVM标准品6瓶,1mL/瓶(0µg/L、0.5µg/L、1.5µg/L、4.5µg/L、13.5µg/L、40.5µg/L);抗体工作液1瓶,10mL;酶标记物工作液1瓶,12mL;20倍浓缩洗涤液1瓶,40mL;2倍浓缩复溶液1瓶,50mL;底物液A液1瓶,7mL;底物液B液1瓶,7mL;终止液1瓶,7mL;高浓度标准品(1µg/mL)1瓶,1mL;盖板膜1张;自封袋1个;说明书1份;质量报告1份。

【注意事项】

1、剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌,防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证,合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、严格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象,则视该批试剂盒为不合格。

稿源:中国兽药信息网